Tuy nhiên, Chōshū sớm không còn lựa chọn nào khác ngoài việc mời gọi Takasugi một lần nữa. Sau khi Chōshū nã pháo vào tàu chiến phương Tây ở eo biển Shimonoseki vào ngày 25 tháng 6 năm 1863, hạm đội hải quân Anh, Pháp, Hà Lan và Mỹ đã bắn phá Shimonoseki, cảng chính của phiên Chōshū vào mùa hè năm sau, nơi mà sau này được gọi là vụ Pháo kích Shimonoseki. Tiếp theo là cuộc đổ bộ của lính thủy đánh bộ Pháp. Trận giao tranh của họ với các đơn vị Chōshū cho thấy sự thua kém của quân đội Nhật Bản truyền thống trước quân đội phương Tây, và thuyết phục các nhà lãnh đạo trong phiên về sự cần thiết tuyệt đối của một cuộc cải tổ quân đội toàn diện. Chính quyền phiên Chōshū đã triệu tậpTakasugi không chỉ thực hiện cuộc cải cách này với tư cách là 'Trưởng quan Quân sự vụ', mà ông - chỉ mới 25 tuổi - còn được giao trách nhiệm đàm phán hòa bình với bốn cường quốc phương Tây.

Trước sự sỉ nhục của quân binh Chōshū trước các cường quốc phương Tây, Takasugi đã nhận ra rằng đối đầu trực tiếp với người nước ngoài không phải là một lựa chọn đúng đắn. Thay vào đó, Nhật Bản phải học hỏi các chiến thuật, kỹ thuật và công nghệ quân sự từ phương Tây. Takasugi đã tổ chức lại lực lượng dân quân Kiheitai của mình thành một đơn vị súng trường với những khẩu súng trường hiện đại nhất, đồng thời du nhập việc huấn luyện chiến lược và chiến thuật phương Tây. Hơn nữa, Takasugi đã sử dụng ảnh hưởng của mình với phong trào Tôn vương Nhương di để thúc đẩy một chính sách hòa giải hơn đối với phương Tây và do đó, 'phong trào Tôn vương Nhương di' dần phát triển thành phong trào chống Mạc phủ với việc lật đổ gia tộc Tokugawa như một phương tiện cần thiết để củng cố đất nước chống lại sự xâm nhập của ngoại bang.

Bị suy yếu bởi trận pháo kích của các cường quốc phương Tây, Chōshū không thể chống chọi với một cuộc thảo phạt do Mạc phủ tiến hành vào mùa thu năm 1864 để trả đũa cho những nỗ lực trước đó của Chōshū nhằm chiếm quyền kiểm soát Kyoto. Lúc đầu, phe bảo thủ ủng hộ hòa giải với Mạc phủ để gìn giữ lãnh địa, chiếm ưu thế trong nền chính trị Chōshū, và Takasugi và một số đồng hương của ông phải rời khỏi phiên trấn để tránh bị bắt giam. Takasugi, chỉ với khoảng một chục thân hữu, bao gồm các nhà lãnh đạo chính trị tương lai như Yamagata Aritomo, Itō Hirobumi và Inoue Kaoru, tập hợp tại Kokura ở Kyūshū và chuẩn bị tiến công phe bảo thủ ở Chōshū. Cuộc nội chiến Chōshū sau đó bắt đầu vào ngày 13 tháng 1 năm 1865.

Takasugi đóng một vai trò quan trọng trong cuộc nội chiến này và lực lượng dân quân Kiheitai của ông đã chứng tỏ ưu thế của mình so với đội quân samurai kiểu cũ. Nhờ hàng loạt cuộc tấn công chớp nhoáng và sự hỗ trợ của Katsura Kogorō, Takasugi đã giành được chiến thắng vào tháng 3 năm 1865. Ông trở thành một trong những trung gian chính về chính sách của phiên Chōshū và tiếp tục đóng vai trò là chuyên gia của phiên về khoa học quân sự phương Tây, cống hiến nỗ lực của mình cho việc nhập khẩu vũ khí và nuôi quân. Những cải cách này đã được chứng minh là thành công khi Chōshū chiến thắng trên bốn mặt trận trước cuộc chinh phạt Chōshū lần thứ hai của Mạc phủ vào năm 1866, với chính Kiheitai đã đảm bảo chiến thắng trên hai mặt trận. Những nỗ lực của Takasugi đã khiến một ‘tiểu quốc vũ trang’ quy mô nhỏ thoát khỏi Chōshū, mang lại cho nó sức mạnh quân sự không tương xứng với quy mô tương đối nhỏ. Nhờ chiến thắng trước quân Tokugawa, Mạc phủ bị mất uy tín về sức mạnh quân sự và các phiên trấn đối địch truyền thống đã quyết định kết đồng minh với Chōshū trong các trận chiến tiếp theo dẫn đến cuộc Minh Trị Duy tân và sự kết thúc của Mạc phủ Tokugawa.